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| 掌握配制培養基制備、滅菌與消毒的一般方法和步驟 | |||
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實驗目的：1.了解培養基的配制原理；2.掌握配制培養基的一般方法和步驟。
培養基是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產生代謝產物的營養基質。
原則：目的明確 ;營養協調;控制PH、滲透壓等條件;經濟節約。
方法：查閱文獻;精心設計;試驗比較。
步驟：稱量、熔化、調PH、過濾、分裝、加塞、包扎、滅菌、冷卻、無菌檢查。
培養基種類:
碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽、水。
一、按成份的不同劃分：天然培養基、合成培養基、半合成培養基。
二、按培養基的物理狀態劃分：固體培養基、液體培養基、半固體培養基。
三、按培養基用途劃分：基礎培養基、加富培養基、鑒別培養基、選擇培養基。
牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏蛋白胨培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基。其配方如下：
牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，瓊脂15～20g，水1000mL，PH7.0～7.2(后調)。
高氏1號培養基：高氏1號培養基是用于分離和培養放線菌的合成培養基。其配方如下：
可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，瓊脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。
查氏合成培養基：查氏合成培養基是用來分類和培養霉菌的培養基,其配方如下：
NaNO3 3g,K2HPO4 1g, KCl 0.5g,
MgSO4.7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖 30g, H2O 1000ml,pH自然
麥芽汁培養基：用來培養酵母菌,干麥芽粉加4倍水,在50-60℃保溫糖化3-4小時，用碘液試驗檢查至糖化完全為止,調整糖液濃度,煮沸后，過濾，調pH為6.0。
消毒與滅菌
消毒：消滅病原菌和有害微生物的營養體。
滅菌：殺滅一切微生物的營養體，芽胞和孢子。
方法：
物理的方法：加熱、過濾、輻射
化學的方法：用化學試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細菌代謝機能。如重金屬離子，磺胺類藥物及抗生素等。
加熱法：
干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌
1、火焰灼燒適用于接種環、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。
2、熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣（160－170C）加熱滅菌1－2h，適用于玻璃器皿和培養皿等。原理加熱使蛋白質變性，與水的含量有關，當環境和細胞含水量越大，凝固越快。
3、注意事項：
1）培養基、橡膠制品、塑料制品不能用此法；
2）溫度控制在<180°；
3）物品不能太擠；
4）溫度降至70°時才開箱門。
濕熱法 ：
原理：因為濕熱中菌體吸水，蛋白質容易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。
高壓蒸汽滅菌法：
1、設備：高壓滅菌鍋
2、時間長短根據滅菌物品的種類和數量不同有所變化。
3、適用于培養基、工作服、橡膠物品等的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。
4、注意事項：
1）冷空氣徹底排除；2）加水；3）壓力降為“0”時方可打開。
在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓，所以，當水蒸氣中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。滅菌鍋內留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關系見表2
壓力與溫度的關系表
常壓蒸汽滅菌：對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養基如明膠培養基、牛乳培養基，含糖培養基等可采用此法。徹底滅菌則采用間歇滅菌方法。
煮沸滅菌法：適用注射器和解剖器皿，時間10－15min。
超高溫殺菌：135-150°C和2-8s對牛乳和其它液態食品滅菌。
優點 ：保持食品價值和營養成分。
過濾除菌原理：介質在有壓力時阻隔微生物。
適用范圍：許多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。
設備：蔡氏過濾器，濾膜過濾器。
優缺點：不破壞培養基成分，只適用少量濾液。
注意事項：1、壓力適當；2、無菌條件下進行；3、防止滲透現象。
輻射滅菌原理：紫外線波長在200－300nm，具有殺菌作用，以265-266殺菌力強。此段波長易被細胞中核酸吸收；可產生臭氧和過氧化氫。殺菌效力與強度和時間的乘積成正比。
缺點：穿透力不大。距照射物<1.2m為宜。
應用：無菌室，醫院。
注意事項：對眼睛和皮膚有刺激作用。
化學藥品滅菌原理：應用化學制劑破壞細菌代謝機能。
殺菌劑如重金屬離子；抑菌劑如磺胺類及多數抗生素。
注意：與藥品的濃度高低，時間長短，微生物種類以及微生物所處的環境有關。
常用化學殺菌劑有：乙醇、醋酸、石碳酸
福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾滅等。
微生物的分離、純化及培養技術
分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過程。
為什么要進行純培養：平板上的單一菌落并不 一定保證是一種菌。
常用的分離、純化方法：單細胞挑取法、稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法、平板劃線法。
稀釋涂布平板法 ：
步驟： 1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培養基，高氏I號培養基，查氏培養基冷卻至55-60℃時，混勻后倒平板，牛肉膏蛋白胨培養基倒4皿，高氏I號培養基和查氏培養基各倒3皿。2、制備污水稀釋液：10g土樣，加入90ml無菌水中，在三角瓶中振搖20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml無菌水的試管中，以此類推，制成不同稀釋度。3、涂布：將上述每種培養基平板底面標記稀釋度，然后用無菌吸管從最后三種稀釋度，即10-4、10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對號放入平板上，用玻棒涂布。4、培養：高氏I號和查氏倒置培養于28℃培養箱中培養3-5days，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基在37℃培養1-2days。5、挑菌落：轉至斜面，檢查是否一致，保存。
平板劃線法：
1、倒平板，標記培養基名稱，編號和實驗日期。
2、劃線方法
稀釋混合平板法 ：
1、先加菌
2、倒平板時注意培養基溫度
3、混合均勻。
微生物培養技術
1、斜面接種
2、液體培養基接種
3、穿刺接種
將已接種的斜面、半固體和液體培養基放置培養箱中培養將生長好的菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。
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