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		液體培養(yǎng)基其能有效地提高白芨種子萌發(fā)率

　　白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]為蘭科（Orchidaceae）白芨屬（Bletilla Reichb.f.）多年生宿根草本植物，根呈白色，數(shù)個(gè)相連，故名白芨，別名白及、連及草、甘根。白芨花大色艷，具有較高的觀賞價(jià)值；同時(shí)白芨生有肥厚的肉質(zhì)塊狀假鱗莖，是重要的中藥材之一，具有收斂止血、消腫生肌的功效。隨著白芨的持續(xù)開發(fā)，市場需求連年增長，價(jià)格逐漸上漲，致使野生資源私挖濫采嚴(yán)重，導(dǎo)致白芨野生資源瀕臨枯竭，現(xiàn)有的白芨資源受到嚴(yán)重破壞，已無法滿足市場需求，因而也被國家列為重點(diǎn)保護(hù)野生藥用植物之一。

　　在自然野生狀態(tài)下，成熟的白芨種子呈粉末狀，非常細(xì)小，開花授粉15周后的種子有胚率僅為59%左右，很少萌發(fā)成苗，因此其種子自然萌發(fā)率極低，繁殖困難。目前人工繁育多采用分株繁殖，即將塊莖切成小塊種植，但繁殖系數(shù)低、消耗量大、大面積供種依然較為困難，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。采取植物組織培養(yǎng)技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的白芨實(shí)生苗，是一種快速有效的繁殖方法，目前主要通過將種子撒播在添加激素的固體培養(yǎng)基上萌發(fā)，再生出無菌苗，或誘導(dǎo)原球莖、經(jīng)增殖生根后進(jìn)行快繁，這要涉及4～5種以上的培養(yǎng)基，操作較為繁瑣，且周期較長，最短在110 d內(nèi)方能成苗移栽，相對生產(chǎn)成本較高。為此課題組探討了一種基于液體培養(yǎng)基的白芨種苗離體快繁技術(shù)，

　　該技術(shù)選用液體培養(yǎng)基，用液體懸浮培養(yǎng)萌發(fā)種子，而不是常用的固體培養(yǎng)基表面萌發(fā)，其能有效地提高白芨種子萌發(fā)率，縮短白芨成苗時(shí)間，快速獲得白芨幼苗，下面將該技術(shù)介紹如下。

　　1 未成熟白芨種子離體培養(yǎng)

　　1.1 種子表面滅菌及萌發(fā)

　　選取開花授粉15周后、未開裂的白芨蒴果（含種子），在成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院園林園藝分院實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺上用75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s，去離子水沖洗1～2次。用解剖刀及鑷子仔細(xì)剝開果實(shí)，將種子小心地抖落到無菌組織培養(yǎng)瓶中，加適量5%的次氯酸鈉溶液（滴加1～2滴吐溫-20）消毒20 min。用滅菌的50目細(xì)胞篩過濾種子；再用去離子水沖洗、過濾，反復(fù)4～6次，沖去表面殘留的消毒液。將細(xì)胞篩上過濾的種子以MS+1.0 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的種子萌發(fā)液體培養(yǎng)基沖洗到三角瓶內(nèi)，于25 ℃、100 r/min黑暗培養(yǎng)15-20 d。通常培養(yǎng)5 d后，種子即可萌發(fā)，此時(shí)轉(zhuǎn)入16 h/8 h的光周期環(huán)境下光照培養(yǎng)，一般接種15 d后種子發(fā)育形成葉片。

　　1.2 種子生長成芽

　　將接種15 d、已萌發(fā)的白芨種子經(jīng)50目細(xì)胞篩濾去液體，把種子原球莖接種于MS+0.2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂、pH 5.8的固體誘導(dǎo)成芽培養(yǎng)基上，盡量分散幼苗，每皿約100粒，于25 ℃、16 h/8 h光周期培養(yǎng)。一般培養(yǎng)30 d后，當(dāng)幼芽生長為幼苗，約2 cm左右、根長約0.5 cm左右時(shí)即可進(jìn)行生根培養(yǎng)。

　　1.3 生根培養(yǎng)

　　將平皿中的白芨幼苗接種到1/2 MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+2 g/L活性炭+6 g/L瓊脂、pH 5.8的固體生根培養(yǎng)基上，每瓶接種25～30株，于25 ℃、16 h/8 h光周期環(huán)境里培養(yǎng)，促進(jìn)幼苗和根的生長，提高壯苗生根率。生根培養(yǎng)30 d后，組培苗生長為健壯的成苗，形態(tài)見圖1。

　　1.4 煉苗移栽

　　當(dāng)白芨幼苗的根生長到3～5 cm時(shí)（一般在白芨種子萌發(fā)后75-90 d）即可煉苗移栽，栽前先逐漸揭開瓶蓋適應(yīng)3-5 d外界環(huán)境，期間注意保持瓶內(nèi)濕度。移栽時(shí)用清水洗凈根部瓊脂，避免損傷根及原球莖；將健壯的白芨組培苗移栽到裝好育苗基質(zhì)的穴盤中，選蔬菜或花卉育苗基質(zhì)即可，栽后基質(zhì)澆透水，于煉苗棚中培養(yǎng)。棚中前期注意弱光保濕，第一周應(yīng)覆蓋遮陽網(wǎng)保持弱光，并覆蓋薄膜保濕；移栽15 d后白芨成苗即生長正常，移栽30 d左右即可定植，定植后常規(guī)田間管理，移栽情況見圖2。白芨移栽存活的關(guān)鍵是原球莖的大小及活力，一般有原球莖的幼苗均能移栽存活，存活率可達(dá)95%以上。

　　2 近成熟白芨種子離體培養(yǎng)

　　2.1 種子表面滅菌及萌發(fā)

　　將開花后20周以上、近成熟的白芨蒴果（未開裂，含種子）用紗布包好，自來水流水沖洗30 min，再在超凈工作臺上用75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s，無菌水沖洗1～2次，用解剖刀及鑷子小心剝開果實(shí)，將種子小心撥入無菌組培瓶中，加適量5%次氯酸鈉溶液（滴加2～3滴吐溫-20）消毒20 min。用滅菌的細(xì)胞篩（50目）過濾種子；再用去離子水沖洗、過濾，反復(fù)4～6次，沖去表面殘留的消毒液。將細(xì)胞篩（50目）上過濾的種子，用MS+2.0 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的種子萌發(fā)液體培養(yǎng)基沖洗到三角瓶內(nèi)。25 ℃、100 r/min、黑暗培養(yǎng)15 d。

　　2.2 種子生長成芽

　　已萌發(fā)的種子經(jīng)細(xì)胞篩（50目）濾去液體，將種子原球莖接種于MS+0.1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂、pH 5.8的誘導(dǎo)成芽固體培養(yǎng)基上，盡量分散種子，每皿100粒。25 ℃、16 h/8 h光周期環(huán)境里培養(yǎng)20-30 d。

　　2.3 生根培養(yǎng)

　　將生成的幼苗及增殖的幼苗接種到1/2 MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+0.5 g/L活性炭+6 g/L瓊脂、pH 5.8的生根培養(yǎng)基里，每瓶25～30株，25 ℃、16 h/8 h光周期環(huán)境里培養(yǎng)30-40 d。

　　2.4 煉苗移栽

　　當(dāng)白芨幼苗的根生長到3～5 cm長時(shí)，即可煉苗移栽，栽前先揭開瓶蓋適應(yīng)外界環(huán)境3-5 d。移栽時(shí)先用清水洗凈根部瓊脂，注意不要損傷根及原球莖結(jié)構(gòu)；將健壯的白芨組培苗移栽到裝有育苗基質(zhì)的穴盤中，栽后澆透水，于煉苗棚中繼續(xù)培養(yǎng)。管理上前期注意弱光保濕，第一周應(yīng)加蓋遮陽網(wǎng)保持弱光，并覆蓋薄膜保濕；移栽15 d后白芨成苗即可生長正常，移栽30 d左右即可定植；定植后常規(guī)田間管理。

　　3 成熟白芨種子離體培養(yǎng)

　　3.1 種子表面滅菌及萌發(fā)

　　將成熟的白芨蒴果（未開裂，含種子）用紗布包好，自來水流水沖洗30 min；在超凈工作臺上用75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s，無菌水沖洗1～2次，用解剖刀及鑷子小心剝開果實(shí)，將種子小心撥入無菌組培瓶中，加適量5%次氯酸鈉溶液（滴加2～3滴吐溫-20）消毒20 min。將細(xì)胞篩（50目）上過濾的種子用MS+0.5 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的種子萌發(fā)液體培養(yǎng)基沖洗到三角瓶內(nèi)。25 ℃、100 r/min黑暗培養(yǎng)15 d，萌發(fā)率達(dá)99%。

　　3.2 種子生長成芽

　　已萌發(fā)的種子經(jīng)細(xì)胞篩（50目）濾去液體，將種子原球莖接種于MS+0.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂、pH 5.8的誘導(dǎo)成芽固體培養(yǎng)基上，每皿100粒。25 ℃、16 h/8 h光周期環(huán)境里培養(yǎng)20-30 d。

　　3.3 生根培養(yǎng)

　　將長大的幼苗及增殖的幼苗接種到1/2 MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.0 g/L活性炭+6 g/L瓊脂、pH 5.8的生根培養(yǎng)基上，每瓶25～30株，25 ℃、16 h/8 h光周期環(huán)境里培養(yǎng)30-40 d。

　　3.4 煉苗移栽

　　當(dāng)培養(yǎng)出的白芨幼苗根生長到3～5 cm長時(shí)，煉苗移栽，栽前先揭開瓶蓋適應(yīng)自然條件3-5 d。移栽先時(shí)用自來水洗凈根部附著的瓊脂，小心不要損傷根及原球莖結(jié)構(gòu)；將健壯的白芨組培苗移栽到裝有基質(zhì)的育苗穴盤中，栽后澆透水，于煉苗棚中放置整齊，繼續(xù)煉苗培養(yǎng)。管理上前期注意弱光保濕，第一周應(yīng)加蓋遮陽網(wǎng)保持弱光，并覆蓋薄膜保濕；移栽15 d后白芨成苗即可生長正常，移栽30 d左右即可定植；定植后常規(guī)田間管理。

　　4 小結(jié)

　　采用近成熟的白芨種子進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，能顯著提高種子萌發(fā)率，可達(dá)99%，并加快原球莖的生成速度（15 d左右）。且該技術(shù)操作簡便，成本低廉，每瓶液體培養(yǎng)基可萌發(fā)數(shù)萬粒種子，且種子萌發(fā)整齊，出苗一致，污染率低，結(jié)合簡化的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，大大縮短了白芨組織培養(yǎng)周期，最快能在75～90 d內(nèi)獲得大量健壯的無菌苗用于移栽，實(shí)現(xiàn)了白芨組培苗的高效快速生產(chǎn)，并有效簡化了操作程序，降低了生產(chǎn)成本，便于規(guī)模化生產(chǎn)。

　　作者：熊丙全廖相建鄭雪蓮

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