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		RFLP探針來源于構(gòu)建的DNA 質(zhì)粒文庫(kù)

　　RFLP探針來源于構(gòu)建的DNA 質(zhì)粒文庫(kù)，對(duì)于探針的來源。但也有人用PCR方法直接擴(kuò)增DNA 特定序列作為探針。探針的標(biāo)志主要有兩大類，一是用同位素標(biāo)志，如32P和35S等，早期的RFLP分析就是采用同位素標(biāo)志探針檢測(cè)多態(tài)性，但這種標(biāo)志存在一些缺點(diǎn)如半衰期短，標(biāo)志的DNA 不宜保管以及環(huán)境污染等問題。另一類是非同位素標(biāo)志法，這類方法是許多實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常采用的方法，如生物素標(biāo)記法，最簡(jiǎn)便的用PCR反應(yīng)直接將生物素化－11dUTP作為局部底物合成DNA 鏈，這種產(chǎn)物便可作為核酸探針。另外還有地高辛(Digoxigenin標(biāo)志法，辣根過氧化物酶標(biāo)記法等。

　　主要是利用腺病毒連鎖的溫度敏感性突變對(duì)特定的限制性片段長(zhǎng)度的差異把這一突變定位到限制性片段的物理圖譜上。Zuerner等在研究腎臟鉤端螺旋體分型時(shí)，RFLP最早于1974年作為一種工具用于遺傳研究。采用RFLP技術(shù)幾乎可將腎臟鉤體型內(nèi)各血清亞型區(qū)分進(jìn)去，即在限制性內(nèi)切酶切分析的基礎(chǔ)上再進(jìn)行Southern雜交，但單獨(dú)使用限制性內(nèi)切酶分析則不能全部區(qū)分出各血清亞型，四株酶切圖譜相似的血清株中，用Southern雜交則能逐一加以區(qū)別。Torpstra等和Thiermann等也同時(shí)指出單獨(dú)使用限制性內(nèi)切酶分析也難以區(qū)分具有類似酶切圖譜的鉤體血清亞型。因此輔以核酸雜交的RFLP分析對(duì)腎臟鉤端螺旋體的流行病學(xué)研究及分型鑒別具有重要的實(shí)用意義。

　　除了RELP分析外，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析　目前。還開發(fā)了DNA 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，使DNA 片段多態(tài)性分析技術(shù)更為快速和完善。

　　人們就從已知是多態(tài)性的DNA 序列動(dòng)身，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AmplificFragmentLengthPolymorphAFLP聚合酶鏈反應(yīng)(PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行的一種核酸分析方法。PCR發(fā)明不久。設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后用瓊脂糖電泳和溴化乙錠染色檢查擴(kuò)增產(chǎn)物在數(shù)目和分子量大小上的變化，這種方法與RFLP不同的以擴(kuò)增代替了酶切，其優(yōu)點(diǎn)是防止了RFLP煩瑣的DNA 酶切、轉(zhuǎn)移和雜交等步驟，而且只需要很少量的模板DNA 缺點(diǎn)是必需事先了解位點(diǎn)的序列，這種AFLP又稱為專一擴(kuò)增多態(tài)性(SpecifAmplifiPolymorphSA P如Jefferei等(1988根據(jù)人小衛(wèi)星DNA 序列，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行人 DNA 基因擴(kuò)增，得到高多態(tài)性的小衛(wèi)星擴(kuò)增圖譜，大大減少了模板DNA 需要量。

　　即將DNA 特定序列用PCR方法擴(kuò)增，聚合酶鏈反應(yīng)/限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(PCR/RFLP目前有些研究者將PCR和RFLP結(jié)合起來對(duì)DNA 進(jìn)行研究。其擴(kuò)增產(chǎn)物再用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切分析。朱沛軒等采用PCR/RFLP方法對(duì)100株B群腦炎奈瑟氏菌進(jìn)行分型研究，根據(jù)這類細(xì)菌的1類外膜蛋白基因(PorA 設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增，受試菌株均擴(kuò)增出 116bP片段，以限制性酶MspI消化發(fā)生6-8條酶切片段，通過對(duì)這些片段的長(zhǎng)度和數(shù)量的分析，結(jié)果將受試的100株細(xì)菌分為33種RFLP型(B1-B33其中B20型內(nèi)的菌株數(shù)量最多占31％)且多有致病性(29/31與非致病性的B21B22酶切圖譜中只有個(gè)別小片段位置差別，反映出基因突變后一個(gè)切點(diǎn)移位導(dǎo)致酶切圖譜的微小變化。這種方法分辨率高、重復(fù)性好、簡(jiǎn)單快速。張曉峰等使用PCR/RFLP方法對(duì)康氏立克茨氏體的基因型進(jìn)行了分析，根據(jù)立克茨氏體190KD蛋白基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物并用于擴(kuò)增來自南非、埃塞俄比亞、摩洛哥、印度及俄羅斯等地的七株立克茨氏體、擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)三種不同分子量大小的片段，標(biāo)明這三類菌株的擴(kuò)增基因中核苷酸排列相互不同；擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性酶Rsal及Pstl酶切則可得到四種不同的RFLP圖譜，進(jìn)一步標(biāo)明康氏立克茨氏體各株間基因型存在著差異。

　　從而進(jìn)行多態(tài)性分析。與特異性引物擴(kuò)增有幾個(gè)不同點(diǎn)：⑴ 特異性引物根據(jù)多態(tài)位點(diǎn)DNA 序列設(shè)計(jì)，3.隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA RA PD隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA RandomAmplifiPolymorphDNA 用單個(gè)或單個(gè)以上的隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA 發(fā)生長(zhǎng)度不等的片段。一般成對(duì)使用各長(zhǎng)20bP左右的引物，RA PD引物則完全隨機(jī)，長(zhǎng)度不等，多為8-10bp一般為單個(gè)使用，G＋C含量一般在50％以上；⑵ 特異性引物擴(kuò)增退火溫度較高，堿基配對(duì)要求嚴(yán)格，RA PD退火溫度較低多為 35-36℃，允許適當(dāng)?shù)膲A基錯(cuò)配，從而引發(fā)更多的擴(kuò)增子(Amplicon增加監(jiān)測(cè)多態(tài)性的能力。RA PD引物的序列完全隨機(jī)，幾乎可以用于任何生物而揭示其整個(gè)基因組的多態(tài)性，因此得到廣泛應(yīng)用。孔繁榮等在淋球菌菌種鑒定及分型研究中采用RA PD技術(shù)用隨機(jī)引物對(duì)淋球苗WⅠ、WⅡ、WⅢ三群的基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增、三群細(xì)菌均表示出共有的特征性條帶以及各群特有的條帶，標(biāo)明三群淋球菌的基因組同源性很高，表示型”上的共性占主導(dǎo)地位，另一方面也說明了三群細(xì)菌在基因組DNA 中存在一定差別，因此根據(jù)這種多態(tài)性可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類和鑒定。Feket等采用5個(gè)不同的隨機(jī)引物單獨(dú)或成雙使用對(duì)25株不同的布氐桿菌進(jìn)行隨機(jī)引物擴(kuò)增性片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究。對(duì)未知DNA 序列的布氏桿菌采用隨機(jī)引物擴(kuò)增，結(jié)果顯示在同等擴(kuò)增條件下，不同的布氏桿菌表示出不同的基因類型，因此根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度多態(tài)性可檢測(cè)診斷特異性菌株，解布氏桿菌間的基因關(guān)系，計(jì)算相似系數(shù)等。

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