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| 真菌的冷凍干燥固定化和玻璃化保藏技術概述 | |||
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真菌的保藏技術方法很多，但沒有一種保藏工藝能夠適合所有真菌種類的保藏。Ryan等(2002)從科學、供應以及財政等角度制定了一些原則來指導保藏者選擇合適的保藏技術。一些基本的保藏方法，如斜面移植法、油管保藏法、蒸餾水保藏法、沙土管保藏法、硅膠保藏法等文獻已經為一些真菌的保藏提供選擇，不再進行贅述（Smith & Onions, 1994; Fenell, 1960; Smith et al., 2001; Boesewinkel, 1976; Burdsall, 1994; Perkins, 1962)。以下僅對真菌的冷凍干燥、超低溫凍結、液氮保藏、固定化和玻璃化保藏技術及進展進行概述。
冷凍干燥保藏技術（Freeze drying）
真菌的冷凍干燥保藏技術包括三個主要步驟，一是要培養物冷凍階段；二是冷凍的狀態下的減壓干燥，干燥過程必須避免液體狀態，溫度應保證在-15℃以下，避免溫度反復起伏，控制培養物的水分到5%左右為宜；最后進行真空镕封，在低溫、避光的環境下保藏（Smith, 1983)。冷凍干燥過程中的重要環節是避免低溫傷害，低溫傷害在冷凍和干燥時段都有發生, 其原理可能是細胞膜上液體的結晶體向膠體階段轉變的時候，引起細胞膜流動鑲嵌結構的損害(Tan, 1997)。一些保護劑的應用，如血清、脫脂乳、肌糖、海藻糖以及蛋白胨的應用可以降低這種傷害。采用該技術保藏的微生物菌株有分發時不用事先開啟、便于包裝、降低運輸過程的泄漏危險等優點。冷凍干燥保藏技術適用于一些產孢子的真菌，特別是一些能夠產生子囊孢子和分生孢子的真菌，保藏周期可到20-40年。Tan等采用該技術對真菌的菌絲進行保藏復活研究，大多數情況下，得不出的滿意的結果，(Tan, 1991 )，目前僅有Pertot等 (1977)報道Claviceps spp菌絲可經過冷凍干燥保藏后復活。
超低溫保藏技術
超低溫保藏一般分為兩種方式，一是超低溫冰箱保藏，保藏溫度一般為-70- -80℃；另一種方式為液氮超低溫保藏，根據液氮罐的構造類型，可分為隔氮式和浸氮式，隔氮式是將保藏物保藏于氣相中，保藏溫度一般在-135℃左右，浸氮式是將保藏物保藏在液氮的液面之下，保藏溫度為-196℃。Herry于1663年發現將一些線蟲經過冷凍并通過溶化過程使之復活（Morris, 1981），Polge等(1949) 首先將此技術成功應用保藏鳥類精子，Hwang（1960）首次將此技術應用于真菌的保藏。液氮超低溫保藏技術有三個關鍵環節影響著真菌的保藏效果，一是降溫速率控制理論上保藏前的降溫速率控制越慢越好，1℃/mins降溫速率已完全能夠適合大多數種類真菌的保藏。二是復活過程中保藏物快速升溫到最適溫度，目前處理的方法將保藏的凍存管快速置于37-45℃水浴中，放置1-2分鐘。三是保護劑的種類和濃度選擇，常用的保護劑有甘油、海藻糖、DMSO等。
降溫速率的控制和保護劑的配合使用是為了降低低溫損害風險（Smith & Thomas 1998）。Smith（1983）認為真菌的低溫傷害是由于細胞組織被冰晶破壞和細胞內濃度增高等幾方面互相作用的結果。Merryman 等 (1977)認為細胞的緩沖液的快速波動引發pH的變化，細胞內大分子失水的過程中可導致細胞內部結晶化，引起細胞皺褶等原因導致細胞死亡。細胞膜的破壞是細胞死亡的真正原因，Roquebet & Bury(1993) 在研究Lentinula edodes 菌株降溫過程時認為冰晶對細胞膜的物理破壞作用可能是導致細胞死亡的直接原因。
Ryan & Smith （2003）在對Phytophthora的保藏研究中，比較了10%的DMSO及降溫速率1℃/mins和10%甘油保護劑及降溫速率10℃/mins兩種保藏工藝，在10%的DMSO及降溫速率1℃/mins 的試驗中，67個分離物中65個分離物具有活性，存活率達92.5%；而在10%的甘油及降溫速率10℃/mins的試驗中，保藏后檢測到到了卵孢子和厚垣孢子的形成，沒有卵孢子形成的分離物依然有菌絲的生長。Ryan & Smih在用10%甘油保護劑及降溫速率10℃/mins的保藏工藝用于Diploccarpon rosae 和 Moniliophthora roreri時，保藏的成活率低于50%。為了提高Moniliophthora roreri 菌株的孢子產量，所有的菌株在進行超低溫保藏前事先放在冰箱中低溫處理21d，在此后的活性檢測中，成活率達到了91%，比先前的成活率提高了41%。用不同的保護劑，如海藻糖、甘油、DMSO、肌糖、蛋白胨等，對Serpula lacrymans 進行了保藏處理，各保護劑處理保藏效果的差異不明顯，DMSO的保藏效果最好，成活率達到了89%。液氮的超低溫保藏目前認為是最有效的保藏方法，但對于一些真菌來說，雖然在保護劑和降溫速率控制方面進行了較多的研究，但保藏效果依然不好，例如一些擔子菌類以及Straminipila、Phytophthora、Saprolegnia屬等。
玻璃化技術（Vitrification）
超低溫保藏技術過程必然要經過“玻璃化”過程。“玻璃化”技術實質就是讓水分子處于一種類似于固體狀態而不發生結晶，可以通過空氣干燥、化學物質干燥蒸發水分，滲透濃脫水、海藻鹽包裝脫水、化學保護劑等手段實現“玻璃化”。一是部分的“玻璃化”過程和全部的“玻璃化”過程。部分的玻璃化過程，主要控制細胞膜外的水分結晶，減少細胞破壞，全部“玻璃化”過程要完全阻止細胞內、外冰晶的形成。玻璃化保藏技術在多細胞組織保藏中應用較廣，是用高濃度的保護劑溶液保護保藏物，使之在降溫過程中以“玻璃體”形式存在，從而避免冰晶對細胞組織的破壞。此外，在恢復培養的過程中注意避免晶狀體破碎和及時洗掉對真菌有毒的玻璃化溶液。Ryan & Smith （2002）報道了應用此法成功保藏一些真菌，如Flammulina Boletus Mycena 等屬的一些菌種，而對Phytophthora和 Sarpolegnia 保藏的檢測結果是全部死亡，與常規應用的一些方法相比，高濃度玻璃化溶液對大多數真菌是有毒的，不利于真菌菌株的長期保藏。
固定化技術（Immobilisation）
固定化的保藏技術是將真菌菌株事先包裹在藻酸鈣中并進行超低溫保藏一種保藏技術。固定化的技術方法已用于真菌酶制劑、生防菌株、生物降解等多個方面的研究（Kwak & Rhee, 1992; Pereira & Roberts, 1991; Lestan et al, 1998; Walker & Connick, 1983），用藻酸鈣誘捕固定真菌的也有多方面的報道（Walker & Connick, 1983; Mauperin, et al.,1987; Pereira & Roberts, 1991; Kwak & Rhee, 1992; Daigle & Cotty,1997）。Abdullah等 （1995）發現固定化的技術并不對真菌的菌絲造成傷害，可以擴展用固定化的技術應用于真菌的長期保藏。Smith等 (1992) 建議可應用于一些擔子菌、卵菌以及一些不產孢真菌的保藏。
固定化保藏真菌技術基本過程包括，第一步制備真菌的孢子或菌絲的藻酸鹽的懸浮液；第二步是滴入藻酸鈣的溶液中，此時真菌孢子或菌絲體會包裹在形成的藻酸鈣的小球中，并放置一段時間；第三步將菌絲或孢子小球轉移到高滲溶液中進行脫水；第四步可以按照真菌保藏的一些常規方法保藏，如液氮超低溫保藏、油管保藏、蒸餾水保藏等。
Gilson等(1990)注意到將固定化的小球放置在藻酸鈣的溶液中放置一段時間，可以防止小球破裂。Abdullah等（1995）用固定化的技術對8株擔子菌的菌絲進行了保藏，一年后監測仍有活性。Mauperian等(1987)報道用固定化的方法對外生菌根菌的菌絲進行保藏，4℃冰箱中用蒸餾水保藏法，活性至少保持了5個月。Ryan （2001）用固定化的方法處理Serpula lacrymans 菌絲，并分別做了在-20℃冰箱和20℃蒸餾水保藏兩種處理，經過一個月的保藏，經過固定化處理的菌絲活性顯著高于對照處理。Wood等（2000）報道用固定化技術和超低溫保藏相結合的方法對Dactylorhzia fuchsia and Anacampis morio 的種子以及種子上附帶的擔子菌Ceratobasidium cornigerum菌絲進行保藏處理，保藏效果良好。
真菌保藏技術研究方向是提高菌株的存活率和穩定性、開拓保藏范圍，特別是對不能培養的專一寄生菌，如銹菌以及Halophythora Saprolegnia Aphanomyces 屬的菌種，以及Basidiomycota 和 Glomeromycota 中一些種開展保藏技術研究。Ryan & Ellison (2002) 用原位結合超低溫保藏的技術方法對Puccinia spegazzinii菌株進行了保藏處理，經過保藏后的菌株依然有產生擔孢子的能力，雖然對寄主侵染能力下降，在葉柄的侵染沒有成功，但顯示了固定化和超低溫保藏結合對保藏一些不易保藏真菌有應用的潛力，如內生真菌、地衣、菌根菌、不能培養的真菌等。多數的研究者專注于真菌分類學、酶學、分子生物學等學科進展，專注于發現新的功能基因、生物大分子以及基因、生物大分子的代謝調控功能等，而忽視研究菌株的穩定性、基因完整性的安全長期保藏，一旦由于管理或保藏技術的原因，致使菌株丟失、變異、退化，其先前的研究成果也就不復存在，將重要菌株通過一定的手續存放于專業的菌種保藏機構是可行的一種選擇。
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