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| 發光細菌的試驗：海洋發光細菌和淡水發光菌法 | |||
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發光細菌作為毒性檢測的生物學方法，因其簡便、快速、靈敏且成本較低而日益受到重視。本試驗項目推薦兩個方法。一為國家環境保護局于1995年發布的發光細菌法（GB/T15441-1995)，采用的是海洋發光細菌菌種；二為淡水發光菌法，采用的是淡水型發光菌種。
明亮發光桿菌T3法（A)
本方法適用工業廢水、納污水體及實驗室條件下，可溶性化學物質的水質急性毒性監測。
1．原理
基于發光細菌相對發光度與水樣毒性組分總濃度呈顯著負相關（P≤0.05)，因而可通過生物發光光度計測定水樣的相對發光度，以此表示其急性水平。
水質急性毒性水平可按選用相當的參比物氯化汞濃度（以mg/L為單位）來表征，或選用EC50值（半數有效濃度，以樣品液百分濃度為單位）來表征。
2．樣品的采集與保存
①采樣瓶使用聚四氟乙烯襯墊的玻璃瓶，務必清潔、干燥。采集水樣時，瓶內應充滿水樣不留空氣。采樣后，用塑膠帶將瓶口密封。
②毒性測定應在采樣后6h內進行。否則應在2-5℃下保存樣品，但不得超過24h。報告中應寫明水樣采集時間和測定時間。
③對于含固體懸浮物的樣品須離心或過濾去除，以免干擾測定。
3．儀器設備
①生物發光光度計：配置2ml或5ml測試管。
當氯化汞標準溶液濃度為0.10mg/L時，發光細菌的相對發光度為50%，其誤差不超過±10%。
②2ml或5ml測試樣品管（具標準磨口塞，為制造比色管的玻璃料制作，由專業玻璃儀器廠制造），分別適用于相應型號的生物發光光度計。
③微量注射器：10μl。
④注射器：lml。
⑤定量加液瓶：5ml。
⑥吸管：2ml、10m1、25ml。
⑦試劑瓶：l00ml。
⑧量筒：100ml,500ml。
⑨棕色容量瓶：50ml、250ml、1000ml。
⑩半微量滴定管（配磨口試液瓶，全套儀器均為棕色）：l0ml。
4．試劑和材料
除另有說明外，本方法所用試劑均應為符合國家標準的分析純試劑、蒸餾水或同等純度的水。
①氯化汞HgCl2。
②氯化鈉NaCl，化學純。
③明亮發光桿菌T3小種（PhotobacteriumphosphoreumT3spp.）凍干粉，安瓶瓶包裝，每瓶0.5g，在2-5℃冰箱內有效保存期為6個月。新制備的發光細菌休眠細胞（凍干粉）密度不低于每克800萬個細胞；當按5(3)④步驟將凍干粉復蘇2min后即發光（可在暗室內檢驗，肉眼應見微光），稀釋成工作液后每毫升菌液不低于1.6萬個細胞（(5ml測試管）或2萬個細胞（2ml測試管）（均為稀釋平板法測定）。在生物發光光度計上測出的初始發光量應在600-1900mV之間，低于600mV允許將倍率調至“×2”檔，高于1900mV允許將倍率調整至“×0.5”檔。仍達不到標準者，更換凍干粉。
④氯化鈉溶液，3g/100m1：氯化鈉3g于玻璃容器內，用量筒加蒸餾水l00ml。
⑤氯化鈉溶液，2g/l00ml氯化鈉2g，加蒸餾水l00ml于試劑瓶內，2-5℃保存。
⑥參比物氯化汞標準溶液：0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.22、0.24mg/L。
⑦氯化汞母液，ρ=2000mg/L:1/萬分析天平精稱密封保存良好的無結晶水氯化汞0.1000g于50ml容量瓶中，用3g/100m1氯化鈉溶液稀釋至刻度，置2-5℃冰箱備用，保存期6個月。
⑧氯化汞工作液，ρ=2mg/L：用移液管吸氯化汞2000mg/L母液l0ml于l000ml容量瓶中，用3g/l00ml氯化鈉溶液定容。再用移液管吸取氯化汞20mg/L液25ml于250m1容量瓶中，用3g/l00m]氯化鈉溶液定容。將此液倒入配有半微量滴定管的試液瓶，然后用3g/l00ml氯化鈉溶液將氯化汞2mg/L溶液按表5-3-6稀釋成系列濃度（一律采用50ml容量瓶）。氯化汞工作液保存期不能超過24h，超過者務必重配。
5.試驗程序
(1)稀釋樣品液
①樣品液測定前稀釋的條件：
樣品液預試驗：取事先加氯化鈉至3g/l00ml濃度的樣品母液2m1裝入樣品管，并設一支CK管（氯化鈉3g/100m1溶液），按4②一③所述測定相對發光度。
若測得的樣品，相對發光度低于50％乃至零，欲以EC50表達結果，則需稀釋。
若測得的樣品，相對發光度在1％以上，欲以與相對發光度相當的氯化汞濃度表達結果，則不需稀釋。
②樣品液的稀釋液：樣品液的稀釋液一律用蒸餾水，在定容前一律按構成氯化鈉3g/100ml的濃度添加氯化鈉或濃溶液（母液只能加固體）。
③樣品液稀釋濃度的選擇：
預試驗：按對數系列將樣品液稀釋成五個濃度：100%、10%、1%、0.1%、0.01%（其對數依次為0、-1、-2、-3、-4)，按5(2）和5(3）所述粗測一遍，視1％-100%相對發光度落在哪一濃度范圍。
正式試驗：在1%-100％相對發光度所落在的濃度范圍內增配到6-9個濃度（例如，若落在0.1％-10％之間，則應稀釋成0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%；若落在1％-10％之間，則應稀釋成1%、2%、4%、6%、8%、10%)，按5(2）-(3)所述再測一遍；這6-9個濃度，也可通過查對數表，按等對數間距原則自行確定（例如，若落在1％-10％之間，則應稀釋成10%、6.31%、3.98%、2.51%、1.58%、1.00%其對數相應為1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00，對數間距均為0.2)。
(2)測定條件
①室溫：20-25℃。
同一批樣品在測定過程中要求溫度波動不超過±1℃，且所有測試器皿及試劑、溶液測前1h均置于控溫的測試室內。
②pH：若需測定包括pH影響在內的急性毒性，不應調節待測樣品pH。
若需測定排除pH影響在內的急性毒性，需在測定前將待測樣品和CK（氯化鈉3g/100m1）的pH調至下值：主要含Cu的水樣為4.5，主要含其他金屬的水樣為5.4，主要含有機化合物的水樣為7.0。
③溶解氧：本法只能測定包括溶解氧影響在內的急性毒性。
(3)測定步驟
①試管的排列：于塑料或鐵制試管架上按以下兩種情況排列測試管。
a．按5(1)①所述，樣品母液相對發光度為1％以上者，如下排列：
左側放參比物氯化汞系列濃度溶液管，右側放樣品管。前排放氯化汞溶液和樣品管，后一排放對照（CK）管，后二排放CK預試驗管。每管氯化汞或樣品液均配一管CK（氯化鈉3g/100m1蒸餾水溶液）。設三次重復。每測一批樣品，均需同時配置測定系列濃度氯化汞標準溶液。
b．按5(1)①所述，樣品母液相對發光度為50％以下乃至零者，如下排列：
左側僅放氯化汞0.10mg/L溶液管（作為檢驗發光細菌活性是否正常的參比物濃度，其反應15min后的相對發光度應在50％左右），右側放樣品稀釋液管（從低濃度到高濃度依次排列）。其他同a。每測一批樣品，均需同時配測氯化汞0.10mg/L溶液。
②加3g/l00ml氯化鈉溶液：用5ml的定量加液瓶給每支CK管加2m1或5ml氯化鈉3g/l00ml（據儀器型號而定）。
③加樣品液：用2ml或5ml吸管給每支樣品管加2ml或5ml樣品液（據5(3)②而定）。每個樣品號換一支吸管。
④發光細菌凍干菌劑復蘇
從冰箱冷藏室2-5℃取出含有0.5g發光細菌凍干粉的安瓿瓶和氯化鈉溶液，投入置有冰塊1-1.5L保溫瓶，用lml注射器吸取0.5m1冷的氯化鈉2g/l00m1（適用于5ml測試管）或lml冷的2.5%氯化鈉（適用于2m1測試管）注入已開口的凍干粉安瓿瓶，務必充分混勻。2min后菌即復蘇發光（可在暗室內檢驗，肉眼應見微光）。備用。
⑤儀器的預熱和調零：打開生物發光光度計電源，預熱15min，調零，備用。
⑧檢驗復蘇發光細菌凍千粉質量：另取一空2m1或5ml測試管加2m1或5ml氯化鈉3g/100ml（據5(3)②而定），加10μ1復發光菌液，蓋上瓶塞，用手顛倒五次以達均勻。拔去瓶塞，將該管放入各自型號儀器測試艙內，若發光量立即顯示（或經過5-l0min上升到）600mV以上，此瓶凍干粉可用于測試，低于者按4③處理。菌液發光量先緩慢上升，約持續5-15min，后緩慢下降，約持續4h。滿4h的CK發光量應不低于400mV，低于者更換凍干粉。
⑦給各測試管加復蘇菌液：在發光菌液復蘇穩定（約0.5h)后，按5(3)所述，從左到右，按氯化汞或樣品管（前）-CK管（后）一氯化汞或樣品管（前）-CK管（后）…順序，用10μl微量注射器（勿用定量加液器以減少誤差）準確吸取10μl復蘇菌液，逐一加入各管，蓋上瓶塞，用手顛倒五次，拔去瓶塞，放回原位（每管加菌液間隔時間勿短于30s。每管在加菌液的當時務必精確計時，記錄到秒，即為樣品與發光菌反應起始時間。立即將此時間加15min，記作各管反應終止（即應該讀發光量）的時間。
⑧發光細菌與樣品反應達到終止時間的讀數：按各管原來加菌液的先后順序，當某管達到記錄的反應終止時間，在不加瓶塞的情況下，立即將測試管放入儀器測試艙，讀出其發光量（以光信號轉化的電信號一電壓毫伏數表示）。
⑨有色樣品測定干擾的校正：
a．拿掉儀器樣品艙上的黑色塑料管口；
b．取－2m1測試管（直徑12mm)，加氯化鈉3g/ml溶液2m1，將該管放進一裝有少量氯化鈉3g/100m1溶液的5ml管（直徑20mm）內，要使外管與內管的氯化鈉3g/l00ml液面平齊。此作CK管；
c．另取一2ml測試管，加氯化鈉3g/ml溶液2ml，放入另一裝有少量有色待測樣品液的5ml管內，要使外管與內管的氯化鈉3g/ml液面平齊。此作CKc管；
d．于CK和CKc二管的內管中同時加復蘇發光菌液10μ1（注意：必須是本批樣品測
定所用同一瓶復蘇菌液），立即記時到秒，等反應滿15min，迅速放入儀器測試艙，測定兩支帶有內管的5ml測試管的發光量。分別記下發光量Ll(CK管）和L2(CKc管）；
e．計算因顏色引起的發光量（mV）校正值ΔL=L1一L2；
f.按5(3)⑦和5(3)⑧所述常規步驟測試帶色樣品管及其CK管（氯化鈉3g/l00ml溶液）的發光量（mV)。所有CK管測得之發光量（mV）均須減去校正值ΔL(mV）后才能作為CK發光量（mV)。
有色樣品溶液測定干擾的校正示意圖見圖5-3-1。
6．質量保證與質量控制
①每支發光菌的發光強度和穩定性不盡相同，同批樣品測定過程中應使用同一支發光菌，如果需做氯化汞標準曲線，也應與樣品使用同一支發光菌。如果一支不夠用，可采用同批的兩支混合后使用。
②國際上一般通用反應時間為5min或15min兩種，鑒于我國目前所用發光桿菌的靈敏度和穩定性，采用15min。
③三次重復測定結果相對偏差確定為≤1％。
④測定應在采集樣品后立即進行，在6h內不能測定應低溫保存，但不得超過24h。
⑤關于樣品如何稀釋的問題，一般根據樣品毒性大小決定，但是在試驗中至少要選擇六個不同濃度。如果六個濃度的相對發光度在1%-100％之外，可增配若干個濃度，使之落在1%-100％相對發光度范圍內，以求相關方程。
⑥如果樣品濃度為最高極限濃度（即100%）時，其相對發光率都不能使發光強度減少50%，則對樣品的EC50值只能示為＞100%。
⑦鑒于發光細菌法實驗因素的影響，實驗結果具有一定誤差。在評價毒物的劑量一效應關系時，應確定95％置信區間，即T=a+bC±2SE（SE為剩余標準差），以此求出的EC50也有一定的區間，可根據這些結果確定實驗結果的準確性和真實性。對于實驗結果的重現性，就大多數而言，一般EC50值的變異系數在6％-10%。
7.測試結果的表達
1)計算樣品相對發光度（％），并算出平均值：
相對發光度（%)=氯化汞管或樣品管發光量（mV)/CK管發光量（mV)×100
相對發光度（％）平均值＝（重復1）（%）+（重復2）（%）+（重復3）（%）/3
2）符合5(1)①中樣品母液相對發光度在1％以上者，建立并檢驗氯化汞濃度（C)與其相對發光度（T，％）均值的相關方程，也可以繪制關系曲線。
①求出一元一次線性回歸方程的a（截距）、b（斜率、回歸系數）和r（相關系數），列出方程：
T=a+bC氯化汞
查相關系數顯著水平（P值）表，檢驗所求r值的顯著水平。若P≤0.01，且EC50氯化汞=0.lomg/L±0.02mg/L，則所求相關方程成立；反之，不能成立，必須重測系列氯化汞濃度的發光量。氯化汞溶液配制過夜者，必須重配后再測定。
②也可以據建立的上述方程繪制關系曲線。即指定發光度為10％和90%，代入上式，求出相應的二個氯化汞濃度，在常數坐標紙上，定出二點，畫一直線，即為符合該方程的氯化汞濃度與相對發光度的關系曲線。
3)符合5(1)①中樣品母液相對發光度低于50％乃至零，欲以EC50表示結果者，建立并檢驗樣品稀釋濃度（C）與其相對發光度（T)均值的相關方程，繪制關系曲線。
按7之2)所述方法建立相關方程T=a+bC樣，并檢驗相關系數r、顯著水平（P值）。
若P≤0.05，則所求相關方程成立；反之，不能成立，必須重測樣品稀釋系列濃度的發光量。
8．結果評價和報告
(1)用氯化汞濃度表達樣品毒性
1)適用的條件：符合條件（樣品母液相對發光度＞1%）并按7之2)建立了合格（(P≤0.01、EC50氯化汞=0.10mg/L±0.02mg/L）的氯化汞濃度與其相對發光度相關方程者。
2）表達方法：
①將測得的樣品相對發光度，代入7之2)的相關方程，求出與樣品急性毒性相當的氯化汞濃度（一般用mg/L）表示。
②測試結果報告同時列舉樣品相對發光度及其相當的氯化汞濃度值。
3)適用性：適用于相對發光度在1％以上，特別是50％以上（即不可能出現EC50值）但低于100%（即仍有中、低水平毒性）的樣品毒性測定。
(2)用EC50值表達樣品毒性
1)適用的條件：符合條件（樣品母液相對發光度低于50％乃至零）并按7之3)建立了合格（P≤0.01）的樣品稀釋液濃度與其相對發光度相關方程者。
2）表達方法：
①將T代入7之3)建立的相關方程，求出樣品的EC50值。這里的EC50值以樣品的稀釋濃度（一般用百分濃度）表示。
②測試結果報告列舉樣品的EC50值。
3）適用性：適用于相對發光度在50％以下，特別是零（即毒性水平較高或很高）的樣品毒性測定，后者無法以相當的氯化汞濃度表達毒性。
(3）測定記錄格式（見表5-3-8)
(4）測定結果報告
①實驗室室溫。
②采樣地點、日期、時間。
③氯化汞濃度或樣品稀釋百分濃度與相對發光度的相關方程：
T=a+bC
r= P≤ EC50氯化汞= mg/L
L=a+bC a= b=
回歸方程 r= P＜
④樣品EC50值（稀釋百分濃度）或相對發光度（％）及相當的氯化汞濃度（mg/L）。
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