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| 熊果酸中藥標準品在植物中提取工藝的方法 | |||
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熊果酸別名又叫做烏蘇酸、烏索酸，是屬于有機三萜酸。其熔點 在254-257 攝氏度，是 羥基酸，易溶于熊果酸溶于甲醇、乙醇、丁醇、丁酮、氯仿、丙酮等，不溶于水及石油醚。 味苦，有一定的光學活性，比旋光度 59（c=0.3，cyridine ）作用：近來研究還發現熊果酸是 很好的免疫增強劑,具有較強的免疫增強作用和抗致癌、抗促癌、誘導 F9 畸胎瘤細胞分化和 抗血管生成、抗將血清軟氨酶、抗糖尿病等作用,且毒性小。所以熊果酸有望成為低毒有效 的新型抗癌藥。另外還具有明顯抗氧化功能，因而醫藥和化妝品原料、食品的乳化劑，具有 抗糖尿病作用。 熊果酸在藥用植物中分布廣泛,尤以枇杷葉中含量較高。枇杷葉是傳統的常用中藥 ,具有 止咳、清肺和胃、降氣化痰之功效。研究表明,枇杷葉中含皂苷、苦杏仁苷、熊果酸、齊墩 果酸、丁香素、枸櫞酸鹽、鞣質、維生素 B1 和維生素 C 等。通過提取、分離、純化等步驟 制得熊果酸,工藝簡便易行,為熊果酸的工業化生產和綜合利用枇杷葉資源提供了參考依據。
1 儀器與試劑 1.1 儀器 ES-C600 天平(湘儀天平儀器廠);超聲波振蕩儀(上海 Branson);RE-52 旋轉蒸發儀 ;電熱恒溫水浴鍋; TG16-Ⅱ臺式離心機 (長 沙平凡儀器儀表有限公司);高效液相色譜儀(液相色譜儀用 HP agilent 1100,檢測器用紫外可 見檢測器, SEPU 色譜工作站 3000 )。
1.2 試劑 95%乙醇(武漢宏大化學試劑廠生產,分析純,符合 GB679-94 標準);甲醇(天津市科 密歐化學試劑開發中心提供,色譜純);石油醚(60~90℃,天津市科密歐化學試劑開發中心提供 ); 活性炭;熊果酸、齊敦果酸;枇杷葉,干燥,粉碎備用;水為蒸餾水、 離 子水。
2.1 提取 稱取枇杷葉粉末[過 20 目篩, 100g 置于燒杯中,用 8 倍量 95%乙醇超聲提取 3 次, 每次 30 min。合并 3 次提取液,過濾除去殘渣,減壓回收乙醇,得浸膏。 20 目篩 枇杷葉、粉碎、烘干 乙醇回流提取 趁熱過濾 溶劑濃縮得浸膏 石油醚 24h 浸提 NaOH 溶液水洗 無水乙醇 洗出液（無色) 溶解 活性炭 過濾 熱乙醇 放冷靜置 結晶 白色片狀 加熱 熱乙醇 重結晶 溶解 回流脫色 反復洗殘渣 熊果酸粗品 高效液相
2.2 純化 將浸膏依次用石油醚、1%氫氧化鈉水溶液、水洗至洗出液近無色,烘干。再用無 水乙醇加熱溶解,加活性炭回流脫色 20min,濾過。用熱乙醇反復洗滌殘渣 ,合并濾液及洗液, 蒸去部分乙醇,放冷,靜置,得白色片狀結晶;過濾,濾餅加入乙醇,加熱煮沸,趁熱過濾,濾渣反復 用乙醇重結晶得白色針狀結晶。 圖 1.提取熊果酸的原則工藝流程
2.2.1 大孔吸附樹脂層析法 大孔吸附樹脂是一類不含離子交換基團的交聯聚合物，理化性質穩定，不溶于酸、堿 及有機溶劑，對有機物有濃縮、分離作用且不受無機鹽及離子、低分子化合物的干擾。它的 吸附作用通過表面吸附、表面電性或形成氫鍵而完成。大孔吸附樹脂與有機物的作用力主要 為范德華引力與氫鍵。 首次采用大孔吸附樹脂富集柱和大孔吸附樹脂純化柱串聯的方法分離 純化熊果酸。富集柱優先吸附熊果酸以除去大量雜質，使熊果酸的純度從 28.05%提高到 85.0%以上，再用純化柱除去熊果酸中的部分雜質，使熊果酸的純度進一步提高到 95.0%以 上。分步洗脫富集柱時發現，50%以下的乙醇溶液可以有效除去雜質，而熊果酸則可用 pH 為 10 的 80%乙醇溶液解吸，解吸率為 98.0%以上。在 pH 為 10 的 80%乙醇溶液中，純化柱 對雜質的吸附率為 98.76%，而對熊果酸的吸附率僅為 0.05%。 洗脫劑組合，即水一 20%乙醇一 50%乙醇一 52%乙醇一 80%乙醇(pH=10)，每一段洗 脫劑的體積分別為:50，50，150，100，100ml。將富集柱熊果酸的解吸過程與純化柱雜質的 吸附過程串聯即可達到純化熊果酸的目的。富集柱和純化柱再生容易，經過再生后，樹脂的 吸附率均可恢復到 98%以上;大孔吸附樹脂技術以其獨特的優勢廣泛用于中草藥化學成分的 分離純化，主要用于水溶性物質的分離，如水溶性生物堿、黃酮類化合物、昔類化合物、皂 昔類化合物、多酚類或酸性化合物、糖類、維生素、色素等。
2.3 高效液相色譜法 高效液相色譜用于熊果酸分離測定具有快速、高效、操作方便等優點。用于熊果酸分析 的高效液相色譜柱的固定相為 C18，即十八烷基鍵合相硅膠，流動向以甲醇一水體系為主。 甲醇與水的比例變化較大，從 80:20~97:3 不等。采用甲醇一磷酸鹽緩沖液為流動相，熊果 酸進樣量在 0.251 一 10.0409 呈良好的線性關系，最小檢出限 (信噪比 )3)為 0.1509(HP 一 1050DAD 檢測器)。HPLC 法檢測器大多使用紫外檢測器，檢測波長在 210~220nm 之間。熊 果酸甲醇溶液紫外吸收的最大波長為 204nm， 但甲醇在此波長下亦有很強的背景吸收，為減 少干擾，一般選擇 215lun~220nln 作為熊果酸的檢測波長。HPLC 法測定熊果酸的含量已經 得到長足的發展，采用調節流動相的 pH 值和加入鹽等手段以改善色譜峰峰形和分離度，提 高檢測靈敏度和準確度。
總之，HPLC 法用于熊果酸測定具有快速、高效和操作方便等優點，因此，本研究選用 HPLC 法作為分析檢測手段。 ①色譜條件: 色譜條件:Hypersi1C: ，色譜柱(250nunx4.6mm，10 靦);流動相:甲醇一水一磷酸 二氫鈉一二乙胺(88:12:0.20:0.02(v/v));流動相用微濾膜過濾后，超聲脫氣處理 20min;檢測波 長入=220nm;流速 0.5ml/min;柱溫為 25℃，檢測靈敏度為 0.04。 ②對照品標準樣品溶液的配制:精密稱取熊果酸對照品用甲醇配制成濃度為 1mg·mL-1 的對 照品溶液， 搖勻， 再做梯度稀釋為 20μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1，125μg·mL-1 的熊果酸標準樣品。一進樣量為橫坐標、 峰面積為縱坐標，電腦繪制標準曲線，其回歸方 程：Y=19.22652X-18.19440,R=0.99904. ③提取溶液的配制:精密稱取 0.229g 結晶Ⅰ,甲醇溶解并定容至 25 mL,得供試品 1。精密量取 供試品 1 及對照品溶液混合。 ④高效液相分析:分別精密量取對照品溶液、供試品 1,在上述色譜條件下進行高效液相色譜 分析,在保留時間為 17. 292 min 處出現一單峰。 用面積歸一化法計算供試品 1 的峰面積為 94. 15%。
本實驗除雜過程中,由于熊果酸不溶于水和石油醚,所以分別用水和石油醚去除水溶性和 脂溶性雜質。以 60~90℃的石油醚洗,先浸泡 2 min 再抽濾,濾液棄去,濾渣繼續同法洗數次直 至濾液幾近無色。通過實驗, 1%氫氧化鈉水溶液可以洗去一些酸性物質但洗不去熊果酸。用 水洗時,加水沉降 12 h 后抽濾,同樣洗至濾液近無色。比較沒洗的和洗后的樣品的高效液相 圖 譜,洗過的樣品明顯雜質峰已去掉,只有甲醇的溶劑峰和齊墩果酸以及熊果酸的峰。 在重結晶過程中,用活性炭水浴脫色,過濾后放置有白色片狀物析出,濾出結晶濾液中仍 有少量淡黃色的固體析出,但晶形不好,且高效液相色譜測定圖譜顯示后析出的這些固體中齊 墩果酸的含量漸漸增高。所以用熱甲醇重結晶時可以分離兩種酸但損失產品。另外 ,加入的 活性炭也會吸附產品,造成損失;提取過程中的轉移除雜等步驟也會有損失。在本實驗中測定 的枇杷葉中熊果酸的含量為 9. 987 mg·g-1,而最后提取得率只約有 40%,約損失了 60%,但由 于絕對含量較高,所以以枇杷葉為原料提取熊果酸是可行的,更好的方法有待進一步研究。 在對熊果酸方法進行了較系統的研究后建立的這套提取工藝是最簡單而且最節省時間 和根據理論來講最切合實際的提取方案。在提取過程中還可以借助超聲波輔助提取，隨著科 學技術的不斷進步， 現代高新提取技術有了快速發展， 超聲波輔助提取技術具有省時、 節能 、 對有效成分損害小、提取率高等優點，在現代藥物生產中備受關注。相關文章：在迷迭香植物中提取熊果酸對照品的工藝方法
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