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| 在迷迭香植物中提取熊果酸對照品的工藝方法 | |||
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迷迭香中的化學成分十分的復雜，目前研究比較多的抗氧化成分主要為迷迭香酚、表迷迭香酚、異迷迭香酚、迷迭香酸及黃酮等成分。熊果酸(Ursolic acid,UA)具有抗腫瘤、抗肝炎、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗糖尿病、抗HIV、抗寄生蟲等作用，其結構復雜，尚無合成品，主要靠從植物中提取獲得[5]。從迷迭香中提取熊果酸未見有關報道。本實驗采用溶劑提取法對迷迭香中熊果酸的最佳提取工藝進行了研究，同時采用高效液相色譜法準確對提取物中熊果酸進行定量，為充分利用迷迭香資源提供科學依據。
需要干制迷迭香，由中藥標準對照品研究中心提供;熊果酸標準品;甲醇為色譜純，水為超純水;無水乙醇、香草醛、高氯酸、乙酸均為分析純，廣州化學試劑廠出品。高效液相色譜Jasco-1586(雙泵)，UV-1570紫外檢測器;CO-1560柱箱;LEO超聲波清洗器，大連華洋科技儀器有限公司產品;PPENDORF微量移液器(德國);旋轉蒸發儀，德國Heidolph LABOROTA 4000;UV-2450紫外可見分光光度計，日本島津株式會社公司產品。
迷迭香中熊果酸的定性—高氯酸-香草醛法 精密稱取熊果酸標準品4.7 mg，置于10 ml容量瓶中，甲醇溶解，稀釋至刻度，作為對照品溶液。用微量移液器移取對照品溶液1.00 ml于10 ml容量瓶中，于100℃烘箱中烘干后，冷卻后加入0.5 ml 5%香草醛和0.8 ml高氯酸，在60℃水浴保溫10 min，冷卻后加乙酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，在546 nm處測定吸光度。
含量測定： 高效液相色譜法測定條件 色譜條件：色譜柱為Symmetryshield RP18 (3.9 mm×150 mm,5 μm);流動相為0.2%磷酸二氫鈉-甲醇(14∶86);流速為0.8 ml/min;檢測波長為210 nm;靈敏度為0.16 AFUS;柱溫為室溫(25 ℃)。供試品溶液的制備 稱取迷迭香粉末適量，按L9(34)正交實驗表所列進行提取，提取過程保持溶劑回流狀態，過濾或抽濾除渣，減壓回收乙醇，得浸膏，將浸膏依次用石油醚、氫氧化鈉水溶液、水洗至洗出液近無色，烘干。再用無水乙醇加熱溶解，加活性炭回流脫色，過濾。用熱乙醇反復洗滌殘渣，合并濾液及洗液，蒸去部分乙醇，放冷，靜置，得白色片狀結晶提取物。精密稱取提取物100.0 mg于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。測定 吸取上述對照品溶液和供試品溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，在上述色譜條件下進樣20 μl進行分析，根據HPLC色譜圖中的峰面積，按外標法定量，計算出樣品中熊果酸的含量和提取率。
單因素實驗結果分析：提取溶劑的選擇 稱取迷迭香粉2.0 g，分別用甲醇、乙醇、醋酸乙酯、丙酮作溶劑，以1∶25的料液比，在60℃水浴中提取2 h，按“2.1”項進行測定。結果見表1。由表1可以看出最佳的提取溶劑是乙醇。雖然丙酮的吸光度較大，但因為丙酮有毒，生產工藝要求較高，所以不選擇丙酮作提取溶劑。表1 不同提取溶劑對提取效果的影響。②乙醇濃度的選擇 稱取迷迭香粉2.0 g，分別用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇50 ml，在60℃水浴中提取2 h，按“2.1”項進行測定。結果見表2。從表2可以看出隨著乙醇濃度的增加，提取物的吸光度逐漸升高，說明提取出來的熊果酸在增加。其可能原因是隨著乙醇濃度的增大，乙醇溶液的極性也逐步減弱，而熊果酸又屬于五環三萜類非極性物質，根據相似相溶原理，熊果酸易溶于純的乙醇溶液中。為了回收溶劑方便，選擇乙醇的最佳提取濃度為90%。③料液比的選擇稱取迷迭香粉2.0 g，用90%乙醇分別配制1∶10，1∶15，1∶20，1∶25料液比(g/ml)，在60℃水浴中提取2 h，按“2.1”項進行測定。結果見表3。表2 乙醇濃度對提取效果的影響表3 物料比對提取效果的影響從表3可見，隨著溶劑量的增加，提取物的吸光度逐漸升高，到20倍量以后基本持平。由于料液比增加，會給后處理工序增加困難，而且增加生產成本，在保證提取效果的同時，應盡量減少溶劑用量和降低蒸發濃縮負荷，因此選擇最佳料液比為1∶20。④提取時間的選擇 稱取迷迭香粉2.0 g，用90%乙醇溶液，以1∶20的料液比，在60℃水浴中提取1，2，3，4，8 h，按“2.1”項進行測定。結果見表4。表4 提取時間對提取效果的影響⑤ 提取溫度的選擇 稱取迷迭香2 g，用90%乙醇溶液為溶劑，以1∶20的料液比，在55，60，65，70，75，80，90℃水浴中提取4 h，按“2.1”項進行測定。
隨著溫度的升高，溶劑的粘度減小，分子運動速度加快，浸提液的擴散系數增加，促使浸提速度加快。從表5可以看出，隨著溫度的提高提取物的吸光度也平緩增加，到90℃吸光度下降，可能是因為乙醇在80℃左右沸騰，在接近沸點時提取溫度太高，雜質的溶出量增加而受到影響。所以最佳的提取溫度為80℃。
正交實驗結果分析以不同提取工藝條件下迷迭香中熊果酸的含量為指標，以單因素各影響因子為研究對象，進行L9(34)正交實驗。結果見表6。表6的結果說明，各因素對迷迭香酸提取效果的影響程度依次為B>A>D>C，因素C、D無顯著性差異，這說明提取溫度和提取時間在正交設計的4水平內對迷迭香酸的含量無顯著性影響，而提取時間太長會延長操作周期，對生產不利。因素A、B有顯著性差異，說明料液比和乙醇濃度對迷迭香酸的含量有很大的影響，綜合各因素的k值和直接比較，A3B3C2D1為最佳提取條件。即料液比1∶20，溶劑比為90%的乙醇溶液，提取溫度80℃，提取時間3h。表6 正交實驗結果
提取次數的選擇通過正交實驗得到一個最佳提取工藝條件的組合，按此組合，分別提取1，2，3，4次，以迷迭香酸的提取率為檢測指標，考察提取次數對提取工藝的影響，每個實驗重復做3次，結果見表7。從表7可以看出，2次提取就可將大部分迷迭香酸提出，提取率達92.38%，再增加提取次數，提取率提高不明顯。從經濟角度考慮，本實驗采用2次提取。表7 浸提次數對提取率的影響結合單因素和正交實驗的結果，得出迷迭香中熊果酸酸的最佳提取工藝是：料液比1∶20，溶劑比為90%的乙醇溶液，提取溫度80℃，提取時間3 h，浸提兩次。在最佳條件下熊果酸的提取率為92.38%。相關文章：熊果酸中藥標準品在植物中提取工藝的方法
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